日本脑炎病*（JEV,乙脑）属于*病*家族，其中还包括许多重要的其他人类病原体，如*热病病*（YFV），西尼罗河病*（WNV），蜱传脑炎病*（TBEV）和登革热病*（DENV）。JEV主要由Culex蚊子传播（Rice，），在南亚和东南亚广泛流行。每年大约有例日本脑炎病例发生（Campbelletal,），一半的感染患者恢复后会留下严重的神经性后遗症（Basumataryetal，）。
目前，临床上还没有用于治疗JEV感染的抗病*治疗，疫苗接种是控制疾病的最有效方式。SA14-14-2株是一种源自亲代病*SA14的减*株（Songetal，），在中国、尼泊尔、印度、斯里兰卡以及韩国（Kollaritsch等，年）等已有应用研究。但是作为减*的活疫苗株，SA14-14-2病*恢复到其有*的形式的理论风险仍是存在的。
研究病*复制和发病机制的分子机制将有助于鉴定新型治疗药物和开发更安全的JEV疫苗。具有不同程度*力的病**株的核苷酸序列的比较是鉴定负责病**力潜在分子决定簇的常见方法（Ni＆Barrett，;Nietal，;Tajimaetal，;山口等，;Zhaoetal，）。
SA14/U全长cDNA克隆的构建和表征
病*基因组的化学合成是广泛使用的感染性克隆的构建方法，特别是在没有天然模板的情况下。使用这种方法，Cello等（）首先从已知序列重建脊髓灰质炎病*。随后，类似的方法在包括型流感病*，人内源性逆转录病*，严重急性呼吸综合征冠状病*和WNV的各种病*中有所应用（Becker等，;Lee＆Bieniasz，;Orlinger等，;Tumpey等，）。
在本研究中，通过参考SA14菌株（GenBank登录号U）的完整基因组，采用化学合成首次构建了JEV的cDNA克隆。衍生自cDNA克隆的重组病*RNA不具有感染性，并且使用基因组长度RNA和JEV复制子，发现NS2B-TM和NS4A-R79K的适应性突变对于病*复制是必需的。
NS2B通常被认为作为NS3蛋白酶的辅助因子，在病*复制中发挥功能（Chambers等，;Evans＆Grant，;Jan等，）。NS2B和NS3蛋白酶可以形成异二聚体复合物，其催化NS2A-NS2B和NS2B-NS3的顺式切割，以及多蛋白中NS3-NS4A和NS4B-NS5位点的反式切割（Bera等，）。NS2B含有约40aa的保守亲水结构域侧翼的三个疏水区（Clum等，）。NS2B的疏水区域主要在将NS2B-NS3复合体锚定在宿主内质网（ER）膜中，并激活NS3蛋白酶结构域（Clum等，）中发挥作用。
NS2B-NS3Pro的瞬时表达用于自身切割活性分析
使用体外系统，研究人员发现NS2B中位的Thr-to-Met取代对NS3蛋白酶没有影响。相比之下，NS3蛋白酶突变体或NS2B辅因子突变体损失NS3蛋白酶活性。在YFV中也发现了类似的结果，尽管这些突变仅导致蛋白水解加工的轻微降低（Chambers等，）。因此，NS2B-TM赋予的病*复制的恢复可能涉及NS2B在病*复制中的未知作用，而不是作为NS3蛋白酶的辅因子。最近，通过体外成像测定证明了NS4A和NS2B之间的相互作用（Yuetal，）。NS2B-TM对NS4A-R79K的添加表现出叠加效应，NS2B与NS4A在病*复制中存在遗传或/和物理相互作用。
NS4A已被证明参与病*复制复合物的形成（Miller等，）和免疫逃逸（Ambrose＆Mackenzie，;Liuetal。，），以及诱导自噬（McLeanetal，）。该蛋白包含N-末端胞质区域（aa1-50），脂质双层（pTMS2区域;aa74-）的ER腔侧密切相关的区域和三个跨膜区域（Miller等，）。显然，JEVNS4A中的79残基定位于pTMS2区域。据推测，将pTMS2区域插入ER膜的腔内小叶可能像楔形，导致NS4A诱导的膜弯曲，促进病*复制（Miller等，）。在这个位置，*病*总是喜欢带正电荷的氨基酸-Arg（YFV和TBEV）或Lys（JEV，DENV和WNV）。膜蛋白中的这些带正电荷的残基通常被认为与带负电荷的磷脂头组相互作用，有助于锚定跨膜取向（dePlanque等，;Gleason等，）。Lys更灵活，更容易延伸到表面，其氨基暴露与Arg相比（Baud＆Karlin，）。本文的研究结果表明，NS4A中单个Arg-to-Lys取代完全改变了SA14/U的复制能力。仍然要确定这种替代是否通过影响ER膜中pTMS2区域的锚定来改变NS4A的拓扑结构。
参考：
RecoveryofachemicallysynthesizedJapaneseencephalitisvirusrevealstwocriticaladaptivemutationsinNS2BandNS4A.JournalofGeneralVirology
Peter
