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苏州蓝晓生物科技有限公司
概论
现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。下面我们盘点一下细胞复苏、传代到冻存的步骤和经验，希望对广大科研工作者有所帮助。
细胞复苏
细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
复苏准备
?打开水浴锅加热至37℃。
?超净台上放好离心管（一般15ml的），细胞培养瓶，移液管，紫外灭菌至少20至30分钟，吹风5至10分钟除去臭氧。
?37℃预热好要复苏细胞的培养液，也可以不用预热培养液，根据细胞情况选择。
?向离心管中加约5至10ml培养液，从液氮罐或-80℃中取出冻存细胞，立即将冻存管放入37℃水浴中并轻轻摇动，待融化后（约2min即可）立即将解冻的细胞转移至含培养液的离心管中，-rpm下离心5min，弃上清，加适量完全培养液轻轻吹打重悬细胞后转移至细胞培养瓶中，轻晃使瓶底液体分散均匀，标好细胞名称、代数、复苏日期，显微镜下观察后放入37℃，5%CO2培养箱中。一般贴壁细胞过夜即可贴壁，换液和传代时间根据不同细胞生长情况而定。
细胞复苏注意事项
?复苏时动作要快，尽量减少胞内形成冰晶，影响复苏后细胞活率。
?融化时尽量不要碰到管口，以免容易造成污染。
?若一次性需要复苏细胞很多，可以分批水浴解冻，防止传热不佳使得细胞融化时间延长。
?若需要同时复苏好几种细胞，提前在离心管和培养瓶上做好标记，或记住自己摆放的位置，不要弄混乱。
细胞传代培养
悬浮细胞传代
待培养液中酚红指示剂变*，在已紫外灭菌后的超净台上吸出或倒出细胞悬液至离心管中（根据细胞液的量选择15ml或50ml离心管），-rpm下离心5min，弃去营养匮乏的旧培养液，加预热好的完全培养液适量，轻轻吹打重悬细胞后，吸取适量细胞悬液转移至细胞培养瓶中，或直接取适量细胞悬液至新培养瓶中，再补加一定量新鲜完全培养液进行传代，有些脆弱的细胞用自然沉降法沉降细胞，吸去上面旧培养液加入新的完全培养液后吹散进行传代。传代接种的细胞密度根据不同细胞生长情况而定，一般间隔1-2天即可传代一次。
细胞微载体培养
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。将对细胞无害的微载体颗粒加入培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩增三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，因此细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。细胞主要通过静电引力和范德华力与微载体黏附，这取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。
蓝晓科技的微载体广泛应用在疫苗、单抗、基因治疗病*载体等生物制品的大规模生产中，蓝晓科技自主研发的SeplifeLX-MC-dex1细胞培养微载体在Vero细胞、CHO细胞、T细胞及MDCK细胞等已广泛用于生物制品的大规模生产中，细胞可贴附微球2D表面生长，1g的SeplifeLX-MC-dex1微载体提供cm2的表面积给细胞贴附。
SeplifeLX-MC-dex1技术参数
细胞生长曲线
Vero细胞在两家不同批次微载体的培养基中，24h至96h细胞生长曲线如图1所示。
图1：蓝晓科技细胞培养微载体和进口微载体用于Vero细胞培养生长曲线
细胞生长情况观察
图2：蓝晓科技细胞培养微载体用于Vero细胞培养细胞生长情况观察
SeplifeLX-MC-dex1微载体的应用领域非常广泛，基于微载体生产的疫苗除了新冠以外，还包括脊髓灰质炎、风疹、狂犬病、流感、日本脑炎（乙型脑炎）、呼吸道合胞病*（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。与其他细胞培养工艺相比，微载体培养工艺可以提高产量，降低成本，并减少污染。
苏州蓝晓生物科技有限公司生物分离介质及细胞培养微载体专业供应商
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贴壁细胞传代
待培养瓶底中细胞覆盖率达70%-80%时，在经紫外灭菌后的超净台上，弃去旧细胞培养液，用无菌1*PBS洗涤瓶底细胞1-2次，用1ml（T25培养瓶）或2ml（T75培养瓶）trypsin溶液37℃下作用细胞，待显微镜下细胞回缩变圆，少部分细胞出现流沙状时，快速吸去trypsin溶液，加预热好的新鲜完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落且分散均匀，直接吸取适量细胞悬液转移至新培养瓶中，或-rpm下离心去上清，加适量新鲜完全培养液吹打重悬细胞，然后转移适量细胞悬液至新培养瓶中，再加入一定量完全培养液，摇匀瓶底细胞液后进行培养。
细胞传代培养注意事项
?吹打时每次不要排完移液管中液体，同时控制吹打节奏，这样不容易吹出泡沫，泡沫对细胞有损伤作用，而且很难再显微镜下观察清楚有没有完全吧细胞吹打下来。
?不要等到贴壁细胞完全铺满瓶底，要留有一定空隙时细胞状态才良好。
?消化时最好不要等到细胞成片飘起，否则细胞状态受影响且第二天培养中死细胞较多。
细胞冻存
冻存的细胞要处在指数生长期。悬浮细胞和贴壁细胞经离心后用冻存液重悬，计数，冻存的细胞密度一般3*-1*cells/ml，最好不少于1*cells/ml，否则复苏后难以养起来，将重悬计数后的细胞悬液以1-1.5ml快速分装至各冻存管中，迅速拧紧盖子，放入梯度冻存盒然后置于-80℃过夜，也可以先4℃放置30分钟，再-20℃放置1-2小时，最后-80℃过夜（16-18小时），若梯度冻存盒不够或无冻存盒，可以将冻存管置于泡沫盒中，用棉花包起来，棉花厚度约1cm，置于-80℃过夜，第二天取出-80℃细胞存放至液氮罐中，并在记录好存放位置信息。
冻存准备
?配制好冻存液。一般冻存液为培养液，血清，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪种冻存液配制，血清多多益善，但DMSO都不可以多，以免对细胞造成损伤。
?准备好冻存管，标上细胞名称，代次，冻存批号，冻存日期。
?准备好细胞程序降温盒或冻存用的材料，程序降温盒放置室温后使用。
细胞冻存注意事项
?程序降温盒有无需有*异丙醇填充的，有利于实验人员身体健康。
?DMSO有*且皮肤会吸收，做好防护措施。DMSO本身不长菌，不需要做灭菌处理。
?由-80℃转至液氮时迅速，避免温度上升影响细胞活性。
?每个冻存管不要加入体积太多，以免冻存时凝固体积膨胀，撑开冻存管，且在下次复苏时，融化较慢，导致复苏后细胞存活率不高。
关于苏州蓝晓生物苏州蓝晓生物科技有限公司是蓝晓科技（股票代码：SZ）全资子公司，依托蓝晓科技20多年在分离吸附材料领域丰富的经验和技术积累，在后疫情时代及药品集采的时代背景下应运而生。苏州蓝晓生物科技，在蓝晓科技雄厚资本的支持下，在蓝晓科技生命科学事业部数10年产品研发和技术积累的基础上，汇聚50多人的研发团队，提供从细胞培养及分离纯化到系统装置完整的解决方案，我们将全力助力生命科学及生物制药产业的高质量发展。
——苏州蓝晓生物——ID：seplife
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